虫媒传染病的快速精准实验室诊断
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虫媒传染病的快速精准实验室诊断
本文介绍了当前虫媒传染病的流行病学、临床特征，特别是虫媒传染病常用实验室诊断方法及具有潜在应用价值的新方法，希望能够为我国虫媒传染病的诊断与防控提供参考。
一、流行特征
二、临床特征
三、实验室诊断
虫媒传染病的经典检测方法主要包括病原学检测和血清学检测两个方面。病原体分离鉴定是目前最可靠的确诊方法，尤其是对新发传染病的病原学确诊更为重要。但是由于众多虫媒病原体如立克次体、螺旋体以及寄生虫等难以体外培养［15］，即使部分病原体能够进行细胞培养和动物接种培养，也耗时长、成本高和技术难度大，且可能需要在高等级的病原微生物实验室中进行［15］，因此在临床检验工作中难以实现，且不能满足传染病早期快速诊断的需要，而借助于免疫学方法特别是分子生物学方法则可能实现虫媒传染病的快速精准实验诊断。近年来，随着纳米材料、应用化学、光物理学和生物传感等技术的进步，免疫学检测和分子生物学检测技术也迎来了革命性和创造性的发展，在虫媒传染病的实验室诊断中具有良好的应用前景和发展前途。
（一）免疫学检测
（2）病原体的交叉反应，如黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒等之间的交叉反应很大，无法有效区分，对某些病毒（如登革病毒）也无法进行血清学分型［24］。
（二）分子生物学检测
当前，多种分子生物学检测方法，如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、核酸分子杂交技术和基因芯片技术等，可用于虫媒传染病的基因检测和病原学诊断。其中PCR技术又包括多重PCR、巢式PCR和实时定量PCR技术等，已经成为虫媒病原体感染实验室诊断的重要手段［23］。这些方法的灵敏度应优于培养法、涂片镜检法和免疫学方法，能够较快实现样品中的目标病原体的定性或定量分析。但是由于这些方法需要在有资质的实验室中进行，而虫媒传染病较多分布于山区，当地医疗资源有限，需要将标本长途转运至有资质的实验室，难以实现即时快速检测，从而延误患者的诊断与治疗。目前，随着等温扩增技术与CRISPR/Cas等技术的出现，虫媒病原体的即时快速检测有望实现［25, 26, 27］。此外，随着二代测序技术的发展，宏基因组二代测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）作为一种广谱的检测方法，已成为检测原因不明的虫媒传染病的强有力工具。
1.核酸POCT：随着检测技术的进步、医学检验理念的革新以及国家分级诊疗的持续推进，对POCT的需求越来越多。POCT也是虫媒传播性疾病未来检验的发展方向［28］。Xu等［29］通过结合逆转录环介导等温扩增的原理和CRISPR-Cas12a的靶向切割特点，开发了一种单管快速可视化检测乙型脑炎病毒的方法，在60 min内检测到9个拷贝数/μl的乙脑病毒RNA，且与其他病毒无交叉反应性，特异性极高。You等［30］开发了一种基于CRISPR-Cas12a、上转磷技术（up-converting phosphor technology，UPT）和侧流免疫层析分析（lateral flow immunochromatographic assay，LFA），构建了Cas12a-UPTLFA，用于快速检测鼠疫杆菌，具有高灵敏度和特异性，且便携和易于操作，能实现即时快速检测。本期陈禹希和余方友［31］在《即时检测技术与虫媒传染病的实验诊断：应用与挑战》一文中系统地介绍了POCT在虫媒性病毒病、虫媒性细菌病和虫媒性寄生虫病等的应用现状，指出相较于传统的检测手段，如涂片镜检与分离培养等，POCT具有更高的灵敏度和特异性，而且大多使用便携式检测设备和仪器，从而使操作更简单。当然POCT技术也面临一些问题，包括如何实现标准化的室内质控及如何实现不同来源试剂检测结果的一致性等。基于当前遇到的这些问题，强调未来应建立标准化的POCT检测指南以及系统、完善的质量管理体系，减少POCT检验结果的误差，确保批间检测的一致性，从而使POCT在虫媒传染病的早期快速诊断中发挥优势。
2.mNGS：多研究报道显示虫媒传染病的临床特征不典型，如本期高慧等［23］提到对立克次体病具有诊断意义的典型皮疹或焦痂仅占20%。本期龚萍等［32］《秭归县日本斑点热流行和实验室特征分析》一文中提到只有61.1%的患者具有非瘙痒无痛有晕轮样红斑的陨石坑样黑色焦痂。由于缺乏典型的临床表现，临床医生难以选择合适的实验室生物标志用于明确诊断。高慧等［23］和龚萍等［32］两个研究组先后均采用mNGS技术明确立克次体病诊断。mNGS是一种通过对临床标本中人和病原体的遗传物质（DNA或RNA）构建宏基因组文库后，利用二代测序平台对数十万到数百万条核酸分子序列进行读取，经过生物信息学分析去除人源片段后，可以鉴定数据库中已有基因组序列的病原体，同时获得病原体的序列数和丰度等数据。当发现未知序列时，通过组装全基因组并与现有的病原体基因组进行差异比较和溯源，则有可能发现新的病原体，在比较理想情况下可以对感染的病原实现“一样全检”。相较于其他常规分子生物学方法，mNGS在新发、少见、罕见、变异病原以及混合感染等方面的检测优势明显［33］，众多专家共识把mNGS作为感染性疾病的病原诊断的一种有效方法［34］。mNGS能够同时检出细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体，病原谱覆盖广，而且能够通过非序列同源性的方式发现新病原体。同时极低含量的病原体也可以检测出来，灵敏度相对更高。能对不同来源的样品同时进行检测，样本谱广。本期王曼媛等［35］在《宏基因组测序技术在虫媒传播疾病诊断中的应用与思考》一文中详细介绍了mNGS在虫媒性病毒病、虫媒性细菌病、虫媒性立克次体病、虫媒性螺旋体病和虫媒性寄生虫病的应用现状，肯定了mNGS在这些疾病的诊断以及病原体溯源中的价值，但也指出mNGS有其局限性，包括检测过程影响因素众多、背景微生物的干扰不可避免、不同的方法和平台可能影响检测结果、用于耐药性检测与宿主免疫力的评估尚不成熟等。尽管如此，随着检测流程、检测结果分析和解读等方面的不断优化，未来mNGS有望成为临床表现不典型的虫媒传染病的重要检测工具［36, 37］。
四、总结与展望
尽管虫媒传染病具有很强的地域性与季节性，但随着城市化、生活习惯和交通方式的改变，不仅虫媒传染病会出现跨地区播散，人类也会跨区域跨地区生活与居住。在环境和宿主改变的双重压力下，病原体可发生适应性变异，导致临床症状不典型或不特异，对虫媒病原体及时、准确地检测是虫媒传染病防控的关键，对患者的临床救治也具有重要意义。
受限于虫媒病原体本身复杂的生物学特性，在实验室检测中仍然以经典的病原学检测、常规免疫学检测及常规分子生物学检测方法为主。病原体分离培养是金标准，但是繁琐、不易操作，且很多虫媒病原体并不适用于分离培养；免疫学检测方法在区分急性期和恢复期方面有优势，但在应用中也有局限性；分子生物学技术可以检测样本中的虫媒病原体，以其高灵敏度、高特异性和高扩增效率成为目前虫媒传染病最主要的检测方法。目前随着科学技术的进步，POCT技术和mNGS技术已成为虫媒传染病快速精准检测的重要手段，并为虫媒传染病检测领域的发展开拓出崭新的局面。表1列举了免疫学技术、分子生物学技术、POCT技术和mNGS技术的优缺点以及应用场景。
在实际临床检测中，需保证检测的灵敏度和准确性，确保检测的简便性及快速检测的需求，此外还有考虑检测通量的需求，实现低成本检测等。因此，为了满足临床检测的需求，未来需要不断对检测技术进行创新和改进，检测技术会逐步向高通量、低成本、灵敏精准、简便高效的方向发展，为虫媒传染病的临床诊疗提供更多可靠准确、及时有效的检测结果，以便更好地为临床服务。
引用：李一荣, 谢林林, 蔡建军. 重视虫媒传染病的快速精准实验室诊断[J]. 中华检验医学杂志, 2023, 46(2): 107-112.
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